在细胞培养过程中，正确的培养条件至关重要。针对贴壁细胞的生长和传代，以下是优化的详细步骤和注意事项。

培养条件

1. 气相组成：95%空气与5%二氧化碳

2. 温度：37℃

3. 培养基组成：MEM+10%FBS+1%P/S

传代方法

首次传代建议比例为1:2。

每两天更换一次培养液，以维持细胞的最佳生长状态。

细胞处理步骤

收到细胞后，首先用75%酒精对整个细胞瓶进行喷洒消毒，然后放入超净工作台进行无菌操作。接着，将细胞瓶置于37℃和5% CO2培养箱中静置3-4小时，待细胞适应后再进行其他处理。

显微观察

利用显微镜观察细胞生长情况，并在不同倍数（如40x、100x、200x）下拍照，以便后续售后参考。前三天的照片非常重要，如未提供照片则默认细胞状态良好。

细胞传代步骤

在传代时，如果细胞汇合度未超过80%，则需将完全培养液收集到离心管中，并保留5ml完全培养基继续放入培养箱中。如果细胞密度超过80%，则可直接进行传代。

贴壁细胞传代具体步骤：

1. 去除培养上清，并用不含钙、镁离子的PBS洗涤细胞1-2次。
2. 添加0.25%胰蛋白酶消化液约1-2ml至培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟。观察细胞变圆并脱落后，迅速添加5ml以上完全培养基终止消化。
3. 轻轻吹打细胞以确保其完全脱落，然后将悬液转移至15ml离心管中，1000RPM离心5分钟，弃去上清液，补加1-2ml完全培养基进行重悬。
4. 将细胞悬液按1:2比例分装至两个T25瓶中，补充新鲜完全培养基至5-8ml/瓶，最后放入37℃、5% CO2的细胞培养箱中培养。

悬浮细胞传代步骤：

1. 进行半换液法时，竖放培养瓶静置约1小时，轻吸掉约3ml培养基，然后补充3ml完全培养基，如果培养基颜色变化较慢，可以加500ul FBS。
2. 如需分瓶，可收集细胞悬液入离心管中，1000RPM离心5分钟，弃去上清，补加1-2ml培养基后重悬，将细胞悬液按1:2比例分至新T25瓶中，添加6-8ml新培养基以维持细胞活力。

细胞冻存方法

1. 当细胞覆盖培养瓶的80%面积时，弃去培养液并用PBS清洗细胞。

2. 添加0.25%胰蛋白酶消化液，观察细胞状态后迅速终止消化，接着离心并将细胞沉淀加入无血清冻存液，充分混匀后转移至冻存管中。

3. 冻存细胞需在-80℃冰箱中存放24小时，随后可转入液氮罐进行长期保存。

细胞复苏流程

从液氮中取出细胞冻存管后，需立即将其放入37℃水浴中解冻，待管内无冰晶后擦拭外壁，用含5ml完全培养基的离心管收集解冻液，进行离心和重悬，最终接种到培养瓶中，继续在37℃、5% CO2的环境下培养。

注意事项

在运输过程中，细胞的贴壁性可能受到影响，出现脱落现象是正常的。如有较多细胞脱落，可依据上述步骤进行处理，确保细胞可以顺利生长。尊龙凯时品牌致力于为科研工作者提供优质的细胞培养解决方案，确保您的实验顺利进行。