产品名称：尊龙凯时 pC013-Twinstrep-SUMO-huLwCas13a质粒
产品规格：05ug质粒干粉

在收到产品后，请根据产品管壁标签判断产品形式，并在扩增前准确查找该质粒菌株的抗性、感受态和培养温度。

pC013-Twinstrep-SUMO-huLwCas13a质粒扩增流程

以下为质粒扩增的详细步骤，请严格遵循：

1. 质粒干粉处理

（常温运输，存于-20°C，保质期90天，务必转化挑单克隆培养，切勿直接使用和测序）

• 将收到的质粒干粉在5000rpm离心1分钟，然后加入20μl的去离子水溶解质粒；
• 取1支100μl感受态细胞在冰上解冻10分钟，加入2μl的质粒，并进行冰浴30分钟，接着在42°C热激60秒，注意保持不搅动，随后再冰浴2分钟；（所有操作均需在超净工作台中无菌进行）
• 加入900μl无抗的LB液体培养基，以180rpm震荡37°C培养45分钟；
• 在6000rpm离心5分钟，仅保留100μl上清液重悬细菌沉淀，并涂布至目标质粒抗性的LB平板；（可使用本平台的平板涂布专用玻璃珠，效果优于传统方法）
• 将平板正向培养1小时后，倒置于37°C继续培养14小时；如果培养温度为30°C则需培养20小时；（若菌落过多，可对质粒进行稀释后再转化；若无菌落，则添加10μl质粒进行转化）
• 挑取单个菌落至LB液体培养基中，添加相应抗生素，于220rpm震荡培养14小时，根据实验需要提取质粒。

2. 甘油菌种处理

（冰袋运输，存于-80°C，保质期90天，请务必划线挑单克隆培养）

• 进行四区划线后挑取单菌落培养；对于酵母菌，请先液体复苏，然后再进行四区划线。

3. 穿刺菌种处理

（冰袋运输，存于4°C，保质期7天）

• 实施穿刺接种，液体培养后进行四区划线，再挑取单菌落液体培养。

4. 菌落平板处理

（冰袋运输，存于4°C，保质期7天）

• 直接挑取单菌落至液体培养基中。

5. 液体质粒处理

（冰袋运输，存于-20°C，保质期90天）

• 收到单独提取的液体质粒后可直接使用。

6. 滤纸质粒处理

（常温运输，存于-20°C，保质期90天，请务必转化挑单克隆培养，切勿直接使用和测序）

• 收到后请将滤纸涂圈部分剪下放入EP管中，加入100μl无菌水，湿润滤纸并浸泡5分钟，吸取5μl质粒进行转化，之后全涂。

转化和提取步骤示例

以下为碱裂解法提取质粒的基本步骤：

• 准备20ml灭菌培养管，编号，每管加入8mlLB培养基及8µl相应抗生素；
• 用10µl枪头挑取单个菌落至培养管中，置于37°C震荡过夜；
• 取2ml过夜培养的菌液，加入离心管中，室温10000rpm离心2分钟，去上清；
• 在留有菌体沉淀的离心管中加入250µlBufferP1，充分混匀；
• 加入250µlBufferP2，轻轻上下颠倒混匀得澄清裂解液；
• 加入350µlBufferN3，轻轻上下颠倒混匀，室温10000rpm离心15分钟；
• 注意将上清液转移至洁净的吸附柱中，并于10000rpm离心1分钟；
• 向吸附柱中加入150µlBufferPB，再次离心1分钟；
• 添加400µlBufferPW，离心1分钟后再空离2分钟；
• 将吸附柱置于新的离心管中，通风4分钟以确保乙醇去除；
• 加入90µlBufferEB至吸附膜中央，静置2分钟，离心1分钟；
• 将流水再倒入吸附柱，离心1分钟，从而合并质粒至一离心管中，做好标记后于室温放置2小时，最后-40°C保存质粒。

注意事项

• 使用前将RNA酶加入BufferP1，4°C保存；
• BufferEB在65~70°C水浴预热以提升提取效率。

更多关于质粒载体的信息，请咨询尊龙凯时。此产品及其提取步骤将助您快速完成生物科研目标。